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不僅操作麻煩，全自動(dòng)氮吹儀而且成本很高，難于推廣。只有 耐熱 )*+聚合酶被發(fā)現(xiàn)后，聚合酶鏈反應(yīng)才得到廣泛的應(yīng)用。 / / B=C )*+聚合酶是目前應(yīng)用最廣的耐熱性 )*+聚合酶，是從一種在 -DE-F G溫泉中生活的耐熱菌 中分離提純的，由 H60個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。該酶在 IF G處理 0%經(jīng)過(guò) FD個(gè)反應(yīng)周期酶活性仍 可保持在很高水平。一次性加入可以滿足反應(yīng)的全過(guò)程需要。 B=C )*+聚合酶大約有 ,J, DDD的錯(cuò)配 率。目前已有高保真的 B=C )*+聚合酶。 / / ?@5可以在 )*+自動(dòng)化擴(kuò)增儀上很方便的進(jìn)行。這種擴(kuò)增儀可以根據(jù)輸入的正確程序，自動(dòng)的快速 的改變溫度，調(diào)控各個(gè)循環(huán)周期中模板變性、模板和引物退火及引物延伸的溫度轉(zhuǎn)換，實(shí)現(xiàn)反應(yīng)的自動(dòng)化 操作。各種 ?@5反應(yīng)的操作基本相同，反應(yīng)體系中包括模板 )*+、兩種引物、四種 K*B?、B=C )*+聚合酶 和緩沖液。每個(gè)循環(huán)周期包括三個(gè)反應(yīng)步驟： / / ,L )*+模板變性 //變性溫度一般為 IF G ,F8，待擴(kuò)增的 )*+模板于高溫下變性，雙鏈解開，變成單鏈，作為聚合反應(yīng)的 模板。 / / 0L模板與引物的退火 //退火溫度一般為 FFG 6D8。在退火過(guò)程中，引物分別與待擴(kuò)增的 )*+片段的兩條鏈的 6M端互補(bǔ)配 #"!第三篇 !遺傳信息的傳遞 對(duì)。由于引物的濃度大于待測(cè)模板的濃度，引物與模板結(jié)合的概率遠(yuǎn)大于模板的自身復(fù)性。 ! !"#引物的延伸 ! ! $%&酶的最適溫度為 ’( )，在此溫度下 $%&酶以單鏈 *+,為
模板將單核苷酸逐個(gè)加入到引物的 "端 ，使引物不斷延長(zhǎng)，從而合成新的 *+,鏈。新合成的引物延伸鏈在下一輪循環(huán)時(shí)便可以作為擴(kuò)增的模 板。引物延伸的時(shí)間一般為 .#/ 012以上，反應(yīng)步驟的溫度和時(shí)間可以依據(jù)自己的試驗(yàn)要求自行設(shè)定，一 般要經(jīng)過(guò) (/ 3"4個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物需經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。 !!在第一個(gè)反應(yīng)周期中，分別以互補(bǔ)的兩條 *+,鏈為模板，引物的延伸從模板的 "-端開始，這樣新合成 鏈的 /-端是一段引物的序列， "-端則長(zhǎng)短不等，稱為“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”。從第二個(gè)反應(yīng)周期開始，引物除與原 模板結(jié)合外，也與新合成的鏈結(jié)合。當(dāng)引物與新合成的鏈結(jié)合時(shí)，由于新合成的鏈的 /-端序列是固定的， *+,聚合酶催化新鏈的延伸只能到此為止。這樣就出現(xiàn)了 /-端和 "-端分別對(duì)應(yīng)兩種引物的產(chǎn)物片段，稱 為“短產(chǎn)物片段”。從第二個(gè)反應(yīng)周期起，短產(chǎn)物片段以指數(shù)的方式增加，長(zhǎng)產(chǎn)物片段每個(gè)周期只增加兩 個(gè)（圖 .’ 5）。經(jīng)過(guò) (/ 3"4個(gè)循環(huán)后，短產(chǎn)物片段在反應(yīng)體系中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，不必經(jīng)過(guò)提純即可用于 各種分析。
圖 .’ 5! 678工作原理及長(zhǎng)片斷 9短片斷形成示意圖 ! ! 678的主要用途是擴(kuò)增微量的 *+,，理論上只要有一條雙鏈 *+,作為模板，即可通過(guò) 678擴(kuò)增到足 夠下一步試驗(yàn)需要的 *+,量。 678的另一個(gè)主要用途是基因工程中獲得目的基因。通過(guò) 678獲得目的 基因要注意 $%& *+,聚合酶的錯(cuò)配率，盡可能選用高保真的 $%& *+,聚合酶。 678的第三種主要用途是 通過(guò)檢測(cè) 08+,含量測(cè)定基因的表達(dá)水平。 678的第四種主要用途是進(jìn)行定點(diǎn)突變。將待誘變的堿基 設(shè)計(jì)在引物中，當(dāng)下一輪 678以引物延伸的鏈為模板擴(kuò)增時(shí)， *+,的堿基就產(chǎn)生了定點(diǎn)突變。用這種方 第十七章 !基因技術(shù)#"! 法可以使蛋白質(zhì)的氨基酸產(chǎn)生定向改變。 第四節(jié) ! !"#的序列分析 ! ! "#$序列分析主要有雙脫氧合成末端終止法和化學(xué)修飾法兩種方法。 圖 %& ’!雙脫氧末端終止法測(cè)序 #"!第三篇 !遺傳信息的傳遞 一、雙脫氧合成末端終止法 ! ! "#$%$#&’( )*+,$#的雙脫氧合成末端終止法實(shí)際上是一種試管內(nèi)的復(fù)制 -./互補(bǔ)鏈并使之逐個(gè)核苷 酸延伸的比較分析方法。 ! ! -./序列分析除需要 -./的復(fù)制所必需的四個(gè)條件，即 -./聚合酶、單鏈 -./模板、帶有 01羥基的 引物、四種脫氧核苷三磷酸（ %/23 %223 %423 %523）外，還需要四種脫氧核苷三磷酸的類似物 61，01一雙 脫氧核苷三磷酸（%%.23）。%%.23能夠以它的 71磷酸和它上一位的核苷酸形成正常的 01，71磷酸二酯鍵， 但是 %%.23沒(méi)有 01羥基，下一個(gè)核苷酸不能與之形成 01，71磷酸二酯鍵，使
